0 引言

　　免疫荧光分析技术是新发展起来的精密的免疫标记检测技术，与传统的酶联免疫法及金标法相比，免疫荧光分析技术灵敏度高，特异性强，操作方便，不用放射性物质作为标记物，因此具有无放射性、标记物稳定、便于长期保存、试验重复性好、分析速度快、样品用量少及标准曲线量程宽等优点[1]。荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。荧光的强度与物质数量之间存在正比关系，可通过测定荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的分析。免疫荧光分析技术是目前生物医学检验中常用的快速分析技术，在微生物、病毒抗原或抗体检测、激素检测、肿瘤标志物检测、毒品海洛因、吗啡、摇头丸、氯胺酮等检测领域具有广阔的应用前景。

1 免疫荧光定量检测原理

　　将特异的荧光抗体先固体于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端滴加样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该荧光体发生特异性结合，随着进一步的层析作用，用此抗原的另一个抗体对此复合物进行捕捉，多余的荧光抗体用其二抗进行捕捉，两次捕捉的位置分别称为质控线（C线）和检测线（T线）。当光源照射到检测卡上时，质控线和检测线分别激发出不同强度的荧光，光电转换器接收不同强度的荧光产生不同大小的电信号，电信号的强弱反映出待检测物的浓度，从而实现特异性的免疫诊断。

2 免疫荧光定量分析仪系统设计

　　免疫荧光定量分析仪主要由光学部分、硬件电路部分以及系统软件部分组成。光学部分是荧光定量分析仪的核心部分，用来激发出荧光，而硬件电路部分和系统软件部分则用来进行荧光信号的检测处理以及控制整个仪器的正常运行。

　　2.1 光学部分设计

　　光学部分设计如图1所示，光学部分由光源发射光路和荧光检测光路两部分组成。

　　光源发射光路由LED光源、凸透镜1、滤光片1和凸透镜2组成。LED光源的光轴与凸透镜1、滤光片1以及凸透镜2的光轴在一条线上。光源为绿色(中心波长为580 nm)高亮度LED光源，LED位于发射光路凸透镜1的焦点，这样光源发出的光经凸透镜1后变为平行光，滤光片1采用中心波长580 nm带宽为30 nm的窄带干涉滤光片，平行光经过滤光片1后，入射光中565 nm～595 nm范围以外的光被滤除掉，出射的光为窄带光(565 nm～595 nm)，其经过凸透镜2后，被聚焦到样品上，激发出荧光，荧光波长为610 nm。

　　荧光检测光路由凸透镜3、滤光片2、凸透镜4和光电转换器组成。光电转换器与凸透镜3、滤光片2、凸透镜4的光轴在一条线上。荧光检测光路光轴和发射光路光轴成45°角，最大程度地减少了激发光对荧光信号检测的影响。荧光检测光路光轴和发射光路光轴的交点在检测试纸上，且交点为凸透镜2和凸透镜3的焦点。滤光片2采用中心波长610 nm，带宽为15 nm的窄带干涉滤光片。激发出的荧光被凸透镜3收集后变为平行光，平行光通过滤光片2后，原来的少量激发光会被滤光片滤除掉，仅剩激发出的610 nm左右的荧光信号通过[2-3]。通过滤光片后的光被凸透镜4收集聚焦到荧光检测模块上的光电转换器上，实现光信号到电信号的转换。

　　2.2 系统硬件电路部分设计

　　系统硬件电路的结构框图如图2所示，仪器的测量原理是：处理器控制步进电机带动待检测样本到达检测器的检测口上方，通过发光控制模块控制LED的发光强度以符合测量的强度要求，光电传感器检测荧光信号的强弱，传感器输出信号经放大和滤波处理后进入ADS1252转化为数字信号交给处理器进行处理[4]。

　　图2中检测器框中所示的部分包括上文2.1所描述的光学部分以及部分硬件电路，两部分共同封装在检测器内，提高了检测信号的稳定性和抗干扰能力。检测器硬件电路部分由发光控制模块和荧光检测模块组成。

　　为了保证光源的稳定性，发光控制模块采用了恒流源驱动方式，这样可以有效保证光源发光强度的恒定。对于有的样品，照射光源不宜太强，因此，恒流源采用的是程控调节的恒流源，通过输入不同的数字值，可以控制LED的发光强度。即LED驱动电流的大小可以通过程序进行控制。

　　光电转换器选用内置运放的光电转换芯片OPT101。荧光检测模块包含了光电转换、信号放大滤波、电压偏置、模/数转换等部分。其中，信号放大采用程控放大，模/数转换采用24位的A/D转换芯片ADS1252，可保证足够的转换精度和大的动态检测范围。检测器传输给控制器的是数字电信号，数字信号比模拟信号有更强的抗干扰能力和准确性，这就大大提高了系统的检测精度。

　　2.3 系统软件部分设计

　　系统软件使用C语言进行编写，软件流程图如图3所示。系统初始化主要完成系统各外围模块的配置以及历史设置的读取和配置。待系统初始化完成后，控制电机带动样品卡卡槽出仓，并在显示屏上提示用户插入检测样品卡。系统循环检测样品卡是否插入卡槽内，当检测到样品卡插入后系统打开二维码扫描枪并控制电机带动样品卡移动至扫描枪处进行二维码的读取。二维码包含检测项目、产品批号、标准曲线等信息。系统判断二维码信息有效后打开LED并根据二维码相关信息调整LED亮度同时控制电机带动待检测样本移动至检测器上方进行检测。采集到的数据将以txt文件的形式保存在SD卡内，经一定的算法计算出T线与C线对应波峰的面积比后代入二维码信息中的标准曲线内，得出待检测样品的浓度并将最终的荧光强度曲线及样品的浓度检测结果显示到显示屏上并自动存储和打印检测信息[5]。

3 测试结果及分析

　　本文设计的免疫荧光定量分析仪可以测量血液和尿液中多种物质的浓度，本文以NT-proBNP（N末端脑钠肽前体）的浓度测量为例对仪器的运行效果进行分析。NT-proBNP是由心脏分泌的一种神经内分泌激素 ，已被证明是临床上诊断、治疗及判断心力衰竭患者预后的重要指标[6]。

　　3.1 荧光信号的采集

　　将样品卡插到仪器的卡槽内进行检测得到荧光强度曲线如图4所示。图中横坐标代表数据个数，纵坐标代表光电转换器输出的电压值，单位为mV。

　　3.2 标准直线拟合

　　得到样品荧光强度的曲线后，利用高斯拟合可以计算出T线和C线对应的曲线波峰的面积，利用T线和C线对应波峰的面积可以计算出待检测样品的浓度。这就需要一组标准浓度校验品，根据标准浓度校验品的测量结果，建立一定的数学模型计算出T线和C线对应波峰的面积与样品浓度之间的数学关系。

　　根据标准浓度校验品得到样品浓度与T线对应波峰的面积（用AT表示）与C线对应波峰的面积（用AC表示）之比AT/AC的对应关系如表1所示。

　　由表1中的对应关系，利用最小二乘法得到的样品浓度与AT/AC数学量化关系，如图5所示。

　　由图5可以得出，最小二乘法拟合直线的表达式如式1所示：

　　y=9 912.156x-84.742 8(1)

　　直线拟合相关系数R=0.999 92，说明这6种标准浓度校验品的浓度与AT/AC之间存在良好的线性关系。

　　3.3 系统测量误差分析

　　选择一组同一批次不同浓度标准浓度样品，依据式1对样品浓度进行测量，分析系统的检测误差，得到的测量结果如表2所示。

　　由表2的实测结果可以看出，对于标准浓度样品的测量误差在±8%以内，满足实际的使用要求。下面选取一组医院的病人血液样品，以进口的锐普智能荧光干式定量分析仪作为标准仪器进行对比测量。每个病例取75 L病人血液样本加到样品缓冲液中，将溶液充分混匀后取75 ?滋L混匀后的样本滴加到样品卡的加样孔内，等待15 min后将样品卡插入到仪器的卡槽内得到的测量结果如表3所示。

　　由表3的对比测量结果可以看出，本文设计的免疫荧光定量分析仪与现已商品化的免疫荧光检测仪相比，测量误差在±8%以内，能满足临床应用要求。

4 结论

　　本文设计了免疫荧光定量分析仪，对仪器的光学部分、硬件电路部分以及系统软件部分进行了详细介绍。从多个角度对仪器的运行结果进行了分析，从测试结果可以看出，仪器可以拟合出线性度良好的标准直线，通过对标准校验品的测量试验和与标准仪器的对比试验表明仪器在小型化、快速性的基础上，测量误差能够控制在±8%以内，可以满足临床应用的要求。

参考文献

　　[1] 黄晓群.酶联免疫法、金标法、时间分辨免疫荧光分析法测定HBsAg对比分析[J].中国保健营养：临床医学学刊，2009，18(10)：7-9.

　　[2] 纪建伟，解飞，HARBINSON J．LED激发光源叶绿素荧光参数在线监控系统[J].农业工程学报，2009，25(4)：145-149.

　　[3] 张可可，闫星魁，陈世哲.荧光法海水叶绿素a传感器设计[J].山东科学，2013，26(3)：37-40.

　　[4] 王宜怀，吴瑾，蒋银珍.嵌入式系统原理与实践：ARM Cortex-M4 Kinetis微控制器[M].北京：电子工业出版社，2012.

　　[5] 熊有郑，闵小平，葛胜祥.基于嵌入式Linux的扫描式荧光检测仪的实现[J].工业控制计算机，2013，26(9)：9-10，13.

　　[6] 史晓敏，林箐，徐国宾.血清N末端B型钠尿肽原在心功能评价及慢性充血性心力衰竭诊断中的初步应用[J].中华检验医学杂志，2005，28(1)：37-41.