自DNA双螺旋结构解析开始，人们在探究健康与疾病基因组复杂性与差异性上付出巨大努力，测序通量限制和高昂成本成为人们深入分析基因组的首要障碍，2005年推出高通量测序技术初步解决了这个问题，人类基因组测序成本迅速下降，由此产生一个新名词：下一代测序(next-generation sequencing， NGS)。在过去十多年，NGS不断进化，人类基因组测序成本已经下降至1 000美元/人。

　　一、NGS技术平台、发展趋势及临床应用现状

　　国内临床应用短读长NGS技术主要基于边合成边测序(sequencing-by-synthesis， SBS)的Life平台和Illumina平台。Life Ion-Torrent平台采用单核糖核酸增加(single-nucleotide addition， SNA)方法，Illumina平台依赖于循环可逆终止(cyclic reversible termination， CRT)技术。尽管短读长NGS平台总体准确率较高(>98%)，但读取高AT或高GC片段错误率仍差强人意。由于基因组包含重复序列、结构变异及拷贝数变化，短读长测序平台解析这些信息存在固有缺陷，近几年相继推出基于单分子测序和合成法测序第三代测序。PacBio Biosciences单分子实时测序，其PacBio RS Ⅱ平均测序读长10 000～15 000 bp。2014年，另一种基于纳米单分子测序技术原型机-MinION诞生，平均测序读长>10 000 bp。合成法长读长测序平台发展有2个系统：Illumina长片段合成系统与10×Genomics乳液系统。第三代长读长测序平台单个碱基错误率较高。

　　NGS技术广泛应用于常规临床实践，应用领域包括无创产前检测(noninvasive prenatal test，NIPT)和胚胎植入前遗传学诊断/筛查(preimplantation genetic diagnosis/preimplantation genetic screening，PGD/PGS)、遗传病、肿瘤、药物基因组等。2014年6月，国家食品药品监督管理总局批准首个NGS诊断产品用于胎儿染色体非整倍体检测。NIPT是国内NGS应用最为成熟的领域。NGS应用于PGD/PGS优点在于能够利用单一平台实现单基因病和染色体异常分析。2014年9月我国诞生世界首例应用多重退火成环循环扩增技术进行胚胎全基因组扩增NGS测序试管婴儿。随着检测费用降低和基因解读能力提高，NGS应用遗传病特别是罕见病，已经由基因组合向全外显子测序(whole exome sequencing，WES)和全基因组测序(whole genome sequencing，WGS)转变。2010年，应用WES技术仅通过4个病例WES即发现米勒综合征致病基因DHODH。2016年一项前瞻性研究评估证实单病例WES作为一线分子检测技术用于新生儿单基因疾病诊疗临床效用性。2016年另一项涉及54个国家1 000个家庭研究表明，WGS对未确诊疾病诊断率比经典遗传诊断方法还高。

　　目前肿瘤NGS检测主要应用于遗传性肿瘤综合征筛查和体细胞突变分析。NGS使肿瘤防治措施前移至预防阶段。大量研究证实某些遗传性肿瘤与关键基因突变相关，2017版美国国立综合癌症网络指南指出可利用NGS检测相关基因突变并行遗传咨询。如与遗传性乳腺癌和卵巢癌、林奇综合征和神经纤维瘤等相关高外显率基因突变等，此外还有一些中等外显率和低外显率基因。NGS在体细胞突变分析领域应用最为广泛，通过NGS分析肿瘤起始、发展和转移阶段遗传变异及相关驱动突变和伴随突变，有助于肿瘤患者分类、预后、靶向治疗、耐药性分析。国际上相继成立多个测序计划致力于破译癌症细胞突变模式。癌症基因组计划已经发掘近500万个肿瘤体细胞基因突变，并建立了全世界最大、最广泛的癌症体细胞突变数据库。这些大量前期工作为后续NGS临床应用打下坚实基础。如今临床利用肿瘤热点突变基因组合，可在1 d内对几百个肿瘤相关基因几千个热点突变位点进行快速检测。

　　肿瘤液体活检和单细胞测序是NGS应用新方向。肿瘤患者外周血含有循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)或者游离肿瘤DNA(circulating tumour DNA，ctDNA)。CTC和ctDNA取材便利，适用于肿瘤个体化诊断、预后、复发风险评估。2014年一项非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者血浆ctDNA NGS检测发现，对Ⅱ～Ⅳ期NSCLC检测敏感性100%。由于常规测序样品来源均是多细胞混合DNA，得到的序列信息是一群细胞基因信息平均值，或其中占优势数量细胞DNA信息，而单个细胞特性被忽视。单细胞NGS测序能够揭示细胞个体间差异，可为肿瘤分子分型和个体化治疗提供精细化指导，有助于准确理解肿瘤内部异质性和肿瘤演进。

　　越来越多证据表明，在相关药物代谢通路，编码药物代谢酶或相关蛋白基因遗传变异决定个体药物反应或药物敏感性。不同患者对同一药物毒性和疗效有不同反应。临床药物基因组学发展日新月异。截至目前，美国食品药品管理局公布了140余种药物，建议通过遗传信息指导其合理使用，美国临床遗传药理学应用委员会发布了35个药物临床药物基因组学应用指南。目前个体化用药主要针对某种药品开展一个或少数几个基因分型筛查。例如某些针对表皮生长因子受体靶向药基因突变检测、铂类药物相关敏感性基因检测和细胞色素P450家族基因如CYP2D6分型检测等。影响药物代谢或敏感性基因很多，应用NGS技术可以得到单个患者成百上千个基因分型结果，全面指导其用药。

　　二、NGS技术临床应用质控问题的现状和解决办法初探

　　NGS检测比常规分子检测复杂，实验操作部分和生物信息分析部分包括众多实验处理和分析程序。从样本制备到数据分析，NGS过程每一步都可能混入错误。因此凸显临床检测质控重要性。2015年，国家卫生计生委临床检验中心NGS检测体细胞突变有效性室间质评结果分析表明，64家参评实验室仅33家检测性能达到标准，只有17家实验室能正确识别基因组合所有突变，充分反映NGS检测过程复杂性和制定统一检测规范迫切性[12]。目前NGS缺乏统一行业规范和检测标准，导致不同实验室不同平台检测结果无法比较。需要对NGS实验操作部分和生信分析部分建立执行标准和质控监测事项。包括建立标准操作流程、验证流程、质量管理体系、数据可靠性验证等。生物信息分析部分应包括：变异结果描述、附带结果报道、数据储存和版本可追溯性等。此外，标准品应用应贯穿在NGS检测整个流程。

　　三、NGS技术临床应用数据分析要点和报告内容及格式要求

　　NGS实验室对变异结果描述及报告需遵循专业组织建议与指导。建议遵循人类基因组变异协会命名指南和美国医学遗传学与基因组学学会遗传疾病变异分类指导。为避免结果混淆，在撰写临床结果报告时，需要详细列出每个变异位点对应的转录本版本号及蛋白编号[12，14]。在描述疑似致病性变异时，需充分考虑疾病表型、不同人群发病率、外显率及功能学实验，并需要充分利用一些公共数据库。对于一些外显子组或基因组检测来说，评估一个基因对疾病影响程度，了解不同变异类型对疾病贡献度及这些变异遗传模式至关重要[12，15]。报告内容和格式要求可参考中国医师协会检验医师分会发布的《临床基因检验诊断报告模式专家共识》、美国分子病理学会、美国临床肿瘤学会和美国病理学会专家共识。以及欧盟NGS诊断指南[17]。NGS检测报告清晰性和一致性至关重要，应准确客观地描述所检验结果，避免引起歧义。内容总体应该明确简洁并具有充分解释。

　　四、我国NGS技术发展需要注意的几个问题

　　当前国内NGS技术硬件和国外发展同步，但软件建设滞后，硬件建设可以通过购买迅速完成，软件建设需要长时间积累。软件建设包括适合国内国情的规范的检测指南，合理有效的监管措施，完善数据库系统以及符合患者需求的遗传咨询体系等。此外，为保证临床和检测实验室沟通顺畅，需要积极提倡中文人类表型标准用语。随着基因测序技术飞速发展，获取基因数据越来越便捷，与之对应表型信息采集效率滞后。由于临床医学历史悠久，疾病命名和分类复杂多样;很多疾病存在临床变异性，不同医师对于患者描述也存在差异。模糊表型信息与基因数据连接存在障碍，给基因数据解读带来困难。

　　五、展望

　　随着NGS技术不断改进，高通量长读长NGS将是大势所趋，检测对象将逐渐从DNA层面向RNA层面转移。新一代NGS检测灵敏度、准确性和操作便捷性将大大提高。我们有理由相信随着检测费用持续下降、测序方法优化升级、数据解读能力智能化以及临床经验不断积累，人员培训、数据处理、质量控制、伦理等问题都将迎刃而解，NGS技术将会逐渐成为临床主要且常规的检测项目。